BIOQUÍMICA

CROMATOGRAFÍA DE AMINOÁCIDOS

AUTORES:

Pamela Valdivieso

Joselyn Caminos

1.-OBJETIVOS

1.1.OBJETIVO GENERAL:

Determinar la cromatografía de los aminoácidos.

1.2.OBJETIVOS ESPECÍFICOS

Conocer las dos fases que presenta la cromatografía.
Comparar el resultado entre la cromatografía de aminoácidos obtenidos y el estándar.

2.-MARCO TEÓRICO:

CROMATOGRAFÍA

La cromatografía es un método físico de separación para la caracterización de mezclas complejas, la cual tiene aplicación en todas las ramas de la ciencia. Es un conjunto de técnicas basadas en el principio de retención selectiva, cuyo objetivo es separar los distintos componentes de una mezcla, permitiendo identificar y determinar las cantidades de dichos componentes. Diferencias sutiles en el coeficiente de partición de los compuestos da como resultado una retención diferencial sobre la fase estacionaria y por tanto una separación efectiva en función de los tiempos de retención de cada componente de la mezcla.

La cromatografía puede cumplir dos funciones básicas que no se excluyen mutuamente:

Separar los componentes de la mezcla, para obtenerlos más puros y que puedan ser usados posteriormente (etapa final de muchas síntesis).

Medir la proporción de los componentes de la mezcla (finalidad analítica). En este caso, las cantidades de material empleadas son pequeñas.

tipos de cromatografía más utilizados para la separación de aminoácidos

CROMATOGRAFÍA EN CAPA FINA.

La cromatografía en capa fina consiste en la separación de mezclas de moléculas mediante el principio del reparto entre dos fases. En general, una cromatografía se realiza permitiendo que la mezcla de moléculas que se desea separar (lo que corresponde a la muestra) interaccione con un medio o matriz de soporte que se denomina fase estacionaria. Un segundo medio (la fase móvil) que es inmiscible con la fase estacionaria se hace fluir a través de ésta para "lavar" (eluír) a las moléculas en la muestra.

En la cromatografía de capa fina, la fase estacionaria es una delgada capa de un soporte sólido granulado, tales como gel de sílica, alúmina, ácido silícico u otros, que se depositan sobre una placa de vidrio, aluminio u otro soporte inerte. Para que adquiera firmeza y no se desmorone, la capa de fase estacionaria se aglutina con una pequeña cantidad de sulfato de calcio u otro agente cementante. Las muestras se aplican añadiendo pequeñas gotas de solución en un pequeño círculo cerca del extremo inferior de la placa. La gota se deja secar y si se desea poner más muestra se pueden aplicar más gotas, cuidando de que la mancha no se haga demasiado grande.

Cromatografía líquida en columnas de intercambio aniónico

En este caso, los aminoácidos se hacen pasar por una columna de resina con un grupo catiónico. Los aminoácidos, según su carga se van a unir a la columna y luego, mediante un cambio gradual en el pH del solvente que se aplica a la columna, se va eluyendo cada aminoácido a un pH distinto (según su punto isoeléctrico). Como algunos aminoácidos son más difíciles de separar que otros, a menudo es necesario emplear una columna corta para separar un grupo de aminoácidos y una columna larga para separar los aminoácidos restantes

Cromatografía líquida de alta resolución en columnas de fase reversa.

Este método consiste en aplicar los aminoácidos disueltos en una fase acuosa acidificada a una columna de sílice unida a una cadena hidrocarbonada. Los aminoácidos, según su polaridad se van a unir a la columna y entonces el eluyente se mezcla gradualmente con cantidades cada vez mayores de un solvente menos polar que el agua. Los aminoácidos van siendo lavados de la columna conforme la polaridad del solvente baja lo suficiente.

Cromatografía de Reparto

En la presente práctica llevaremos a cabo una cromatografía de reparto, en capa fina, para la separación de aminoácidos. En la cromatografía de reparto los componentes de una mezcla se separan en base a una distribución diferente entre la fase móvil yla fase estacionaria. El movimiento relativo de las moléculas a lo largo del sistema cromatográfico es el resultado de un equilibrio entre las fuerzas de transmisión o arrastre ejercido por la fase móvil en su desplazamiento sobre la fase estacionaria y las fuerzas que tienden a frenar dicho desplazamiento. Las fuerzas de frenado pueden ser tanto de reparto (basado en criterios de solubilidad) como de adsorción.

SEPARACIÓN DE AMINOÁCIDOS.

Las mezclas de aminoácidos pueden separarse en placas de capa fina de gel de sílica, empleando como fase móvil butanol: agua: ácido acético (4:1:1). Las manchas de los aminoácidos pueden detectarse sobre la placa desarrollada, si después de secarla se asperja con una solución de ninhidrina.

Los aminoácidos aparecen como manchas púrpura sobre un fondo ligeramente amarillento. Sin embargo, la prolina (que no produce amonio libre al reaccionar con ninhidrina) genera una mancha de color amarillo obscuro.

Este método, aunque no es muy sensible, se empleó con frecuencia en los primeros estudios de la composición de las proteínas. En la actualidad ha sido desplazado por la cromatografía líquida de alta resolución, ya que esta última es más confiable para la cuantificación y tiene mayor sensibilidad si los aminoácidos se detectan por fluorescencia.

3.-PROCEDIMIENTO:

4.- CÁLCULOS:

RESULTADOS TEÓRICOS

Ácido aspartico

Rf1 = (3/13.5)

Rf1 = 0.222

Trip

Rf2 = (4,8/13.5)

Rf2 = 0.35

Tir

Rf3= (5,2/13.5)

Rf3 = 0.38

T eni

Rf4 = (6,4/13.5)

Rf4 = 0.47

Hidrólisis gluten

Rf5 = (0,5/13.5)

Rf5 = 0.037

5.- DISCUSIÓN:

Las características que tuvo el papel de cromatografía en la cual tuvo un solvente adecuado ya que nos identifica los 4 aminoácidos presentes en la muestra de gluten , en este caso no hubo aminoácidos no identificados.

El solvente utilizado da una buena separación, las sustancias no identificadas deben correr con otro solvente y hacer correr por mayor tiempo para que la separación sea mejor la cual la hidrólisis de gluten nos identifica los cuatro aminoacidos.

6.- CONCLUSIONES:

La Fase Móvil es un Gas y la Fase Estacionaria puede ser un sólido.
En la muestra problema hay una mezcla de cuatro aminoácidos presentes en una muestra de gluten en el cual todos han sido identificados.